Technology弊社技術

弊社技術紹介資料(PDF)

無細胞タンパク質合成系とは?

無細胞タンパク質合成系とは、タンパク質合成反応に必要な各種因 子(リボソーム、伸長因子等)を含んだ細胞抽出液にエネルギー源等のタンパク質合成反応に必要な成分を加えることにより生物の遺伝情報翻訳系を試験管内に取り揃え、目的タンパク質をコードしている mRNA を鋳型とし てタンパク質を合成する技術です。

これまでに大腸菌、小麦胚芽、ウサ ギ網状赤血球、昆虫培養細胞、及びヒト培養細胞由来等の抽出液を用いた無細胞タンパク質合成に関する研究が行われ、様々な無細胞タンパク質合成キットも開発されています。

細胞抽出液を用い試験管内で目的タンパク質を合成する技術

無細胞タンパク質合成系のメリット

従来の細胞系と比べた場合、下記のメリットがあります。

生きた細胞を使用しないため、細胞の培養から開放される
一般に短時間で反応を完結させることができる
多検体処理が可能である
細胞にとって毒性となるタンパク質も生産できる
非天然型アミノ酸を導入できるので目的タンパク質の標識が容易である
生細胞を用いずに済むので遺伝子組換え実験に該当しない

カイコ無細胞タンパク質合成系とは?

沖縄工業高等専門学校の伊東教授らにより構築された技術で、安定して高い合成量が得られる実用的なカイコ幼虫後部絹糸腺抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系です。

これまでの検討により、反応液 1ml あたり約 70μg 以上の合成を確認することが出来たタンパク質もあり、このタンパク質合成量は、古くより商品化されてきたウサギ網状赤血球抽出液の無細胞タンパク質合成系の値と比べ 20 倍以上です。

カイコ無細胞タンパク質合成系

カイコ無細胞系を用いたタンパク質の合成例

米国食品医薬品局(FDA)承認薬のターゲットとなったタンパク質 646 種のうち、

  • 製薬会社の開発パイプラインに多く使われていること
  • 過去 10 年間に論文掲載数が増えていること
  • 合成が難しい GPCR、トランスポーター、イオンチャネル、及び核内受容体などの膜タンパク質を対象から除外すること

を基準とし、9種類の疾患関連タンパク質の合成を検討しました。

その結果、今回検討した9種類のタンパク質いずれについても合成可能なことが判明しました。

合成産物の
ウエスタンブロット解析結果

カイコ無細胞タンパク質合成系を用いたタンパク質の合成例

今回検討した9種類のタンパク質について、いずれのタンパク質も合成可能であることが判明しました。

使用したタンパク質の名称

Abbreviation Protein
JAK2 Janus kinase 2
MMP2 Matrix Metalloproteinase-2
PTGS2 Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2
SRC Proto-oncogene non-receptor tyrosine-protein kinase
MAPK1 Mitogen-Activated Protein Kinase 1
VEGFA Vascular Endothelial Growth Factor A
IL6 Interleukin-6
TNF Tumor Necrosis Factor
IL1B Interleukin-1 beta

カイコ無細胞系で合成したタンパク質の可溶性確認

合成産物のウエスタンブロット解析による可溶性の確認

カイコ無細胞タンパク質合成系

カイコ無細胞タンパク質合成系

カイコ無細胞タンパク質合成系

今回検討した9種類のタンパク質は、
いずれも可溶性として合成できることが確認出来ました。

上記にて合成が確認された9種類のタンパク質について、それらが可溶性として合成されているかの検討を行いました。

その結果、いずれのタンパク質も可溶性タンパク質として合成されていることを確認しました。

更に、今回用いたタグを用いてそれぞれのタンパク質を精製した結果、いずれのタンパク質も一段階の精製により、ほぼ単一なバンドにまで精製されていることも確認できました。

今回検討した9種類のタンパク質は、いずれも可溶性として合成できることが確認出来ました

カイコ無細胞系と他の合成系の比較

様々な無細胞タンパク質合成系の特徴は以下の通りです。

カイコ無細胞タンパク質合成系は、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽、大腸菌等の無細胞タンパク質合成系と比較して、高い合成量を示し、生理活性を有する状態でのタンパク質合成が可能です。

更に、アフィニティクロマトグラフィーで精製することで、簡便に夾雑物の少ない目的タンパク質の供給が可能なタンパク質合成系です。

合成したタンパク質について
抽出液の
由来
合成量 分解 生理活性 非天然
アミノ酸の導入
夾雑物
ウサギ網状赤血球 可能
コムギ胚芽 可能
大腸菌
(S30画分)
制限 可能
大腸菌
(再構成系)
なし 制限 可能 なし
カイコ
無細胞系
可能

▶表は横にスクロールできます

カイコ無細胞タンパク質合成系に関連する弊社代表取締役・伊東昌章の論文等

カイコ無細胞タンパク質受託合成サービス

特徴

  • 真核生物由来タンパク質の合成に
  • 高いタンパク質合成能
  • スピード納品(15営業日)

カイコ絹糸腺の高いタンパク質合成能を利用した無細胞タンパク質合成サービスです。絹糸腺はタンパク質合成に特化した器官であり、大量のタンパク質が合成されます。 本サービスでは、後部絹糸腺抽出液を用いることで70 μg/mL以上の高いタンパク質合成量を実現しました。
ヒトなど哺乳類由来のタンパク質を高確率で可溶化合成可能です。迅速に合成できるため、短期間で目的タンパク質をお届けできます。

サービス内容

お客様からのご依頼
お問い合わせ

お客様による
情報開示*1

弊社から
お客様へ
お見積もり

お客様から
目的遺伝子の
ご提供

弊社にて
発現ベクターの構築

DNA
シークエンシング*2

mRNA合成

タンパク質合成

タンパク質精製

ウエスタン解析

*1必要に応じて秘密保持契約を締結。

*2弊社にて構築した発現プラスミドのDNAシークエンシングを外部委託で実施。
DNAシークエンシングにより納期が変更になる可能性がある場合には、ご連絡致します。

納品物

  • 合成サンプル(反応液2 mL分)
  • 試験報告書

納期

  • 15営業日~

*弊社にプラスミドDNAが到着後
15営業日となります。

●価格

アフィニティ精製込み アフィニティ精製無し
1件 450,000円 390,000円
2件 720,000円 624,000円
5件 1,575,000円 1,365,000円
10件 2,925,000円 2,535,000円

●オプション

詳細はお問い合わせください。


このタンパク質受託合成サービスの開始を記念して、キャンペーンを実施致します。
(キャンペーン受付期間:2022年9月5日から2022年12月末迄)


キャンペーンでは、通常価格450,000円(税抜)のところ、ご成約頂いた先着5件*に限り、

・発現プラスミド構築、
・タンパク質合成、
・タンパク質精製


まで含め、1件あたり250,000円(税抜)でタンパク質受託合成を承ります。

*大変恐縮ですが、本キャンペーンは1研究室あたり1件のご注文とさせていただきます。
また、本サービスの開始は2022年10月17日ですので、それ以前に遺伝子をお送り頂いた場合においても、
2022年10月17日から15営業日での納品になりますので、併せてご了承ください。

タンパク質の受託合成をご検討中の皆様のアクセスをお待ちしております。

●メールフォームでのお問い合わせ

メールフォームはこちら

Technical Briefing Material (PDF)

About Cell-free protein synthesis system

Cell-free protein synthesis system is a technology to synthesize proteins using mRNA encoding the target protein as a template, by arranging the genetic information translation system of an organism in a test tube by adding components necessary for protein synthesis reactions, such as energy sources, to cell extracts containing various factors (ribosomes, elongation factors, etc.) necessary for protein synthesis reactions.

To date, various cell-free protein synthesis methods have been developed using extracts from E. coli, wheat germ, rabbit reticulocyte, cultured insect cells, and cultured human cells.

細胞抽出液を用い試験管内で目的タンパク質を合成する技術

Advantages of Cell-Free Protein Synthesis Systems

Compared with conventional cell-based systems, cell-free protein synthesis systems have the following advantages

No living cells are used, so cells are not cultured.
Generally, the reaction can be completed in a short time.
Multiple samples can be processed.
Proteins that are toxic to cells can be produced.
Labeling of target proteins is easy because non-natural amino acids can be introduced.
Does not require the use of living cells, so it does not fall under the category of genetic recombination experiments.

About the silkworm cell-free protein synthesis system

It is a practical cell-free protein synthesis system using silkworm larval silk gland extract that can stably synthesize high amounts of proteins.

In our previous studies, we were able to confirm the synthesis of more than 70 µg of protein per 1 ml of reaction solution, which is more than 20 times higher than that of the cell-free protein synthesis system using rabbit reticulocyte extract, which has been commercialized for a long time.

カイコ無細胞タンパク質合成系

Examples of protein synthesis using our silkworm cell-free systems

Of the 646 proteins targeted for U.S. Food and Drug Administration (FDA)-approved drugs,

  • Being used in many pharmaceutical companies' development pipelines
  • Increased number of publications over the past decade
  • Exclude difficult-to-synthesize membrane proteins such as GPCRs, transporters, ion channels, and nuclear receptors

The synthesis of nine disease-related proteins was examined based on the following criteria.

As a result, it was found that all of the nine proteins examined in this study can be synthesized.

Confirmation of protein synthesis and sokubilization by Western blot analysis using supernatant samples

カイコ無細胞タンパク質合成系を用いたタンパク質の合成例

Silkworm cell-free protein synthesis system:
Capable of highly efficient synthesis of disease-related proteins in soluble form.

Name of protein used

Abbreviation Protein
JAK2 Janus kinase 2
MMP2 Matrix Metalloproteinase-2
PTGS2 Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2
SRC Proto-oncogene non-receptor tyrosine-protein kinase
MAPK1 Mitogen-Activated Protein Kinase 1
VEGFA Vascular Endothelial Growth Factor A
IL6 Interleukin-6
TNF Tumor Necrosis Factor
IL1B Interleukin-1 beta

Confirmation of solubility of proteins synthesized by our silkworm cell-free system

Confirmation of solubility by Western blot analysis of synthesis products

カイコ無細胞タンパク質合成系

カイコ無細胞タンパク質合成系

カイコ無細胞タンパク質合成系

For the nine proteins confirmed to be synthesized above, we examined whether they were synthesized as soluble proteins or not.

As a result, we confirmed that all of the proteins were synthesized as soluble proteins.

Furthermore, the results of purification of each protein using the tags used in this study showed that each protein was purified to almost a single band by a single-step purification process.

All of the nine proteins examined in this study can be synthesized as soluble proteins.

Comparison of Silkworm Cell-Free Systems with Other Synthetic Systems

The various cell-free protein synthesis systems are characterized as follows.

Compared to cell-free protein synthesis systems such as rabbit reticulocyte, wheat germ, and E. coli, the silkworm cell-free protein synthesis system shows higher synthesis and can synthesize proteins in a physiologically active state.

Furthermore, this protein synthesis system can easily supply target proteins with few foreign substances by purification with affinity chromatography.

synthesized protein
Origin of the extract Quantity disassembly activity Introduction of
nonnatural amino acids
impurity
rabbit reticulum red blood cell Low Little High Possible Much
Wheat embryo bud High Little Middle Pssible Little
E.coli
(S30 fraction)
High Much Restricted Possible Little
E.coli
(Reconstituted)
Middle No Restricted Possible No
silkworm
cell-free system
High Little High Possible Little

▶Please scroll sideways for the table.

Articles to our silkworm cell-free protein synthesis system.

Silkworm Cell-Free Protein Synthesis Service
(This service is available only in Japan)

Features

  • For synthesis of eukaryotic proteins
  • High protein synthesis capacity
  • Speedy delivery (15 working days)

This is a cell-free protein synthesis service utilizing the high protein synthesis capacity of silkworm silk glands. Silkworm silk glands are specialized organs for protein synthesis, and a large amount of proteins are synthesized. In this service, a high protein synthesis rate of more than 70 μg/mL is achieved by using the posterior silk gland extract.
Proteins of mammalian origin such as human can be solubilized and synthesized with high probability. Since it can be synthesized rapidly, the target protein can be delivered in a short period of time.

OTHERSその他

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